La PCR en Temps Réel

La technique de PCR quantitative est une technologie de la biologie moléculaire récemment découvrit. Elle devient, à nos jours, de plus en plus recommandé dans différents secteurs d’activité.

Principe : 

La base de cette technique, comme son nom l’indique, est la détection et la quantification en temps réel d’un reporter fluorescent. 

Durant la réaction d’amplification, l’émission de la fluorescence est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés pendant la réaction. En observant la quantité de fluorescence émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phase exponentielle où la première augmentation significative dans la quantité d’amplicons est en corrélation directe avec la quantité initiale de la matrice originale cible.

Technologies de détection :

Tous les systèmes de PCR en temps réel reposent sur la détection et la quantification d’un émetteur fluorescent pendant le processus d’amplification et il existe, en fait,  deux principes généraux pour la détection quantitative des amplicons : 

*les agents se liant à l’ADN double brin (ex. SYBR Green I) :

Le SYBR Green I est un composé organique aromatique qui a la capacité de se lier aux acides nucléiques et d'émettre une fluorescence. 

Principe :

Le SYBR green I est une molécule pouvant se fixer sur tous les types d’acides nucléiques double brin. Une fois fixé, il devient un très bon fluorophore. Ainsi, le complexe ADN double brin/SYBR green I absorbe la lumière bleue (λmax = 497 nm) et émet de la lumière verte (λmax = 520 nm). L'agent peut également se lier préférentiellement à de l'ADN double brin mais peut également se lier à de l'ADN simple brin avec des performances moindres et des longueurs d'onde d'excitation et d'émission légèrement différentes.

*les sondes fluorescentes (ex. Taq Man) :

La sonde TaqMan consiste en un fluorophore attaché de manière covalente à l'extrémité 5´ d'un oligonucléotide et en un désactivateur (quencher) à l'extrémité 3´

Principe :

Le principe de la sonde Taqman repose sur l'activité exonucléase 5´–3´ de la Taq polymérase qui clive une sonde marquée lors de son hybridation à la séquence complémentaire permettant l'émission d'une fluorescence.

Auteur : Zeyneb Lassoued

Références :

La PCR en temps réel : principes et applications (Elyse Poitras et Alain Houde)

PCR Applications: Protocols for Functional Genomics